【成功案例】百迈客转录组测序助力于小鼠视网膜退变过程中H3K27me3作用机制的研究
提到转录组，大家心中已了然。因其研究之广，是挖掘疾病功能基因的有利手段，深受科研工作者的青睐，实乃科研之必备佳品。接下来小编就跟各位分享一篇近期的项目文章，一起来看下转录组助力疾病研究的思路吧！
英文题目：DZNep inhibits H3K27me3 deposition and delays retinal degeneration in the rd1 mice
中文题目：转录组测序助力于小鼠视网膜退变过程中H3K27me3作用机制的研究
发表杂志：Cell Death & Disease
影响因子：5.965
合作单位：四川大学华西医院眼科
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色素性视网膜炎（RP）是一种遗传性视网膜退化性疾病，以两阶段过程为特征，先是杆状感光细胞功能逐渐衰退，其次是锥形细胞变性，目前还没有有效的治疗方法。关于该疾病的研究，常用的一种动物模型为rd1小鼠，其携带视杆细胞特异性基因Pde6β的功能丧失型突变。rd1小鼠视网膜病变过程中涉及到多种调节方式，比如细胞凋亡、非凋亡性细胞程序性死亡、细胞内在因素、细胞内钙离子稳态失衡和表观遗传修饰。之前研究报道过在RP小鼠模型中，DNA甲基化和组蛋白乙酰化参与了感光细胞的凋亡调控。但是组蛋白甲基化在RP中的作用还未有过相关报道。
文章研究思路
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rd1视网膜具有高水平的组蛋白H3三甲基化（包括H3K27me3）
组蛋白H3赖氨酸的三甲基化影响基因的转录。基于该观点，首先采用western blotting在刚出生（P0）和出生10天后（P10）的小鼠中鉴定三甲基化水平，rd1小鼠比野生型（wt组）增加20-30%（图A,B）。采用LC-MS/MS在P10视网膜中鉴定组蛋白H3赖氨酸三甲基化位点（图C），rd1中共找出6个位点，与对照相比呈现高三甲基化水平（图D）。结果表明：组蛋白H3赖氨酸三甲基化可能参与了视网膜退行性病变。
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DZNep抑制视网膜退化，改善rd1鼠的视觉功能
为了进一步研究三甲基化的作用机制，采取甲基化抑制处理。DZNep是一种组蛋白甲基化酶抑制剂。对3个鼠龄（P0、P4和P8）的小鼠分别注射3种剂量（1.25μg、2.5μg和5μg）的DZNep处理（对照组给予PBS处理），在P21时收集视网膜。组织学观察结果显示，在wt组中DZNep处理对外核层（ONL）的厚度没有影响（图A,B）， 然而在rd1组中DZNep处理对视杆细胞具有注射剂量和时间依赖性的保护作用。在rd1组中，P0期注射浓度为5μg时，对视杆细胞表现出明显的保护效果（图C-F）。后续通过视网膜电图（ERG）在P14和P21中检测幸存的视杆细胞是否具有视觉功能，结果表明DZNep处理能延缓视杆细胞死亡，并在一定程度上恢复P14 rd1鼠的视觉功能。
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DZNep抑制rd1小鼠离体视网膜组织的Ezh2 蛋白水平, H3K27me3 沉积和钙蛋白酶活性
为了进一步探究DZNep对视细胞的保护机制，体外培养离体视网膜组织。将4种浓度（0.1μM、0.5μM、1μM和1.5μM）DZNep处理后的组织进行蛋白实验。蛋白结果显示，1.0μM对Ezh2蛋白（催化H3K27甲基化基团的添加）和H3K27me3有最强的抑制效果（图A-C）。因此在接下来的体外实验中会采用该浓度。已有一些研究表明DZNep是甲基化转移酶的广效抑制剂，不仅抑制Ezh2和H3K27me3水平，对H3K9me3和H3K79me3也有抑制效果，但在本次实验中并未发现对H3K9me3和H3K79me3的抑制。
与前面体内实验结果相符，在rd1离体组织培养结果中，从P0培养至P10，H3K27me3水平升高，并且DZNep（1.0 μM）将其降到wt组水平。钙蛋白酶活性（其活性降低可以延缓光感受器退变）也表现出相似的结果（图D-F）。结果表明：体外离体组织培养可以表征rd1鼠体内的发病机理，且DZNep可以通过抑制钙蛋白酶活性和H3K27me3（而不是H3K9me3或H3K79me3），对rd1鼠视网膜起到保护作用。
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Rd1鼠视网膜中，Ezh2/H3K27me3 作用于PI3K-Akt 通路
为了探究为什么rd1视网膜出现H3K27me3水平升高，以及DZNep对光感受器的保护机制，接下来进行转录组水平研究。对wt 和 rd1小鼠分别进行DZNep处理(1.0μM，P0+10)和PBS处理。层次聚类分析结果显示，wt与rd1明显分离，DZNep处理组与PBS处理组明显分离，说明转录水平有显著变化（图A）。差异基因富集的通路包括TNF、光传导、局部粘连和PI3K-Akt通路（图B）。
接下来对DZNep相关的差异基因进行详细分析。（1）对wt组基因（groupI）进行通路富集分析，并未有显著结果。与前述实验结果一致。（2）rd1组（groupII）筛选出17个显著富集通路（p<0.05），并且有11个与rd1表型相关（图B）。结果说明可能通过这些通路起到保护作用。富集显著的前3个通路中包括PI3K-Akt通路（图D）。后续对PI3K-Akt（与细胞黏附、细胞生长等相关）进行研究，对该通路的基因（如Akt1、Bcl2、mTOR等）进行qPCR验证（图E）。Chip实验结果表明，DZNep的处理，可以降低H3K27me3在Akt1、Pik3r1和Pik3r3启动子区的沉积，解除对这些基因表达的抑制作用（图F）。Akt蛋白的活性形式磷酸化-Akt，在rd1中是降低的，但DZNep处理后降低水平得到缓解（图G-I）。这个结果与Pik3r1, Pik3r3的RNA水平（图E），PI3K亚基 p110α 和 p85α的蛋白水平是相符的（图G-H）。
已有报道Akt可以使Ezh2蛋白丝氨酸21（ser21）磷酸化（phospho-Ezh2），抑制其甲基转移酶活性，阻止与组蛋白H3的结合。因此H3K27me3 水平与 Akt 活性成负相关。当 rd1中Ezh2蛋白和H3K27me3升高，与wt相比，磷酸化的Ezh2 ser21（phospho-Ezh2 ser21）显著降低（图J–M）。DZNep处理降低了rd1中的Ezh2 表达（图A，J，K）, 升高了phospho-Ezh2 ser21水平（可能去除PI3K抑制，活化Akt），与该结论相符，PI3K 抑制剂LY294002表现出相反结果(图J–M)。
因此，Akt-介导的Ezh2 ser21磷酸化和H3K27me3介导的PI3K亚基表达抑制，形成了一个负反馈调节机制，并有利于rd1视网膜光感受器的功能维持(图N)。
总结：
本研究中，作者鉴定了rd1小鼠的视网膜组蛋白H3的赖氨酸位点的三甲基化，包括赖氨酸27（H3K27me3）。组蛋白甲基化抑制剂DZNep（去氮腺嘌呤）明显降低了钙蛋白酶活性，延缓光感受器功能衰退，并改善rd1小鼠视网膜的ERG（视网膜电流图）响应。RNA测序表明DZNep作用于PI3K-Akt和光感受器分化通路，调节rd1视网膜中光感受器功能，揭示了DZNep对RP的治疗潜能。这些发现表明组蛋白甲基化，特别是H3K27me3沉积是视网膜退行性疾病新的发病机制和治疗靶点，与Atm - / -小鼠中H3K27me3-介导的共济失调毛细血管扩张相类似。
参考文献
DZNep inhibits H3K27me3 deposition and delaysretinal degeneration in the rd1 mice. Cell Death & Disease, 2018, 9(3):310.IF 5.965.